cDNA是qPCR的模板，cDNA的质量直接影响定量PCR（qPCR）的结果。提到cDNA，大家可能会用Nanodrop来测定其浓度和纯度，这样做真的是正确的吗？cDNA质量控制的关键又是什么呢？今天，我们就来了解下如何把控cDNA质量。

cDNA要用Nanodrop测量浓度和纯度？

用Nanodrop测量cDNA浓度和纯度，这是常见的误区之一。

首先，cDNA浓度难以准确定量。逆转录后的产物本身是一个混合体系，含有cDNA、未完全逆转录的RNA、dNTP、残余的引物以及各种蛋白和盐离子等成分，会干扰cDNA的吸光度，影响cDNA浓度的检测结果。

其次，cDNA浓度并不影响qPCR实验最终Ct值。我们以小鼠肌肉组织RNA为模板，用不同试剂盒（dNTP 组分按1 μL / 1.5 μL /2 μL /2.5 μL添加量的梯度检测）分别进行逆转录实验，起始RNA为500 ng。最后采用Nanodrop测定cDNA浓度，并取相同量cDNA分别进行qPCR实验，结果证明：

不同逆转录产品的cDNA浓度相差较大，但定量实验Ct值几乎一致。也就是说，逆转录体系中dNTP 投入量的多少不会影响最终Ct值。

综上，用Nanodrop测量cDNA浓度和纯度是没有必要的。

图1. qPCR检测结果△Ct＜1，且最终Ct值与Nanodrop定量结果无线性关系

质量把控关键：gDNA污染的识别与去除

gDNA的污染主要来源于RNA模板，只要保证RNA模板中没有gDNA残留，一般就不会造成gDNA污染。

那如何识别RNA模板中是否仍含有gDNA残留呢？可以通过在逆转录之前将RNA模板进行琼脂糖凝胶电泳来验证。

如下图所示，泳道上部有明显的杂带，条带拖尾严重模糊不清，则显示可能有gDNA的残留，不建议用于后续的qPCR实验，会对实验结果造成影响。

图2. 高质量RNA（左）和RNA中有gDNA（右）

如果逆转录前没有确认模板中是否含有gDNA，可以在qPCR实验中设立NRC阴性对照组（以未逆转录的RNA作为模板，不添加逆转录酶）验证，如无gDNA污染，NRC是不会扩增的（Ct值＞35）；如果NRC扩增（Ct＜35），而体系中无cDNA，则说明扩增是由gDNA产生的，有污染。

那么发现了gDNA污染该如何去除呢？针对于此，目前主要的解决办法是：在RNA提取时或逆转录前用DNA酶或gDNA清除剂去除。Arcegen CleanRNA脱氧核糖核酸酶I（2 U/uL）（N120005）可对提取后的RNA进行处理，制备无dna RNA，从源头解决困扰；快速一链cDNA合成反转录预混液（含gDNA消化，用于qPCR）（N132062）、一链cDNA合成反转录预混液（含gDNA消化，用于qPCR）（N132061）、快速gDNA消化与反转一步法预混液（用于qPCR）（N132063），试剂盒中包含了gDNA消化液，可以在逆转录前去除gDNA，十分便捷。

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