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这么简单!解除AAV的肝脏毒性只需加个小RNA!

作者:上海吉凯基因医学科技股份有限公司 2023-02-01T15:00 (访问量:7144)

近年来,使用腺相关病毒(AAV)载体进行体内基因转移的临床试验数量稳步增加。出色的安全性,以及广泛靶组织的高效转导,使AAV载体成为体内基因治疗的首选平台。即便安全性高,但也不代表AAV没有任何的毒性作用,尤其是肝脏毒性。


肝脏是人体重要的代谢器官,而AAV具有较为强烈的噬肝性,尤其是高剂量的AAV会导致大量的病毒颗粒在肝脏聚集及表达,这可能会导致临床问题,以及动物实验数据不准确,那么如何解决这个问题呢?


脊髓性肌萎缩症(SMA)是一种常染色体隐性、儿童期发病的运动神经元疾病。SMA的起因是SMN1突变或缺失,这种蛋白质的缺乏与运动神经元死亡直接相关,导致肌肉控制、力量和功能的逐渐丧失,从而导致吞咽和呼吸困难,最终个体死亡。Onasemnogene abeparvovec(OA)是单剂量静脉内基因疗法,通过AAV9递送SMN1解决SMA的单基因疾病。然而,它会引起免疫反应,导致肝脏产生的酶增加。


基因治疗先驱James M. Wilson指出高剂量的AAV有潜在毒性1,一名患有肝酶缺乏症的患者,18岁的Jesse Gelsinger在接受基因治疗四天后死亡。Gelsinger在试验中接受了最高剂量,3.8x1015个病毒颗粒。高剂量的AAV载体导致对宿主的两种独立影响:对肝细胞的直接损伤,以及全身炎症和相关的凝血病的激活。


miR-122是肝脏特异性表达的miRNA,肖2等人将其5个拷贝的靶序列miR-122T插入许多AAV载体的3′非翻译区(UTR)中,可以有效降低静脉注射AAV对肝脏的损伤:

将AAV9-CB-Luc-5xmiR-122T载体和不含miR-122T的对照AAV9-CB-Luc通过尾静脉注射以1×1012的剂量递送到6周龄的小鼠中,三周后处死,分析骨骼肌、心肌和肝脏的荧光素酶活性:

结果显示,带有miR-122T的组比对照在肝脏表达降低了50倍。为了进一步评估miR-122T对降低肝脏转基因表达的影响,作者利用心肌特异性启动子en-MHC-TNT和报告基因LacZ进行了小鼠实验,将组织冷冻切片并进行X-gal染色。注射含有 miR-122T的载体的小鼠肝脏中 LacZ 表达量降低了约 70 倍:


虽然AAV对肝脏毒性不全部由基因在肝脏的表达引起的,一部分是肝脏处的免疫细胞识别到病毒进而引发免疫反应,但后者很难优化,而一些应用性的实验表明,只阻断外源基因在肝脏的非必要表达能够大大降低肝脏毒性。



应用案例


案例一

Benjamin3等人开发了一种全新的、静脉递送、针对中枢神经系统内皮的外壳——AAV-BI30,在相对较低的全身剂量下,该AAV病毒能够有效转导成年C57BL/6小鼠的大脑,视网膜和脊髓脉管系统中的大部分动脉,毛细血管和静脉内皮细胞。


作者从病毒注射后开始,每24小时称重小鼠,连续20天,在给药后一周,低剂量1×1011的AAV呈现出了不良反应,表现为体重减轻、嗜睡行为,在测试的最高剂量1x1012下死亡。尸检显示肝细胞转导强烈,伴有异常的核形态(图C)。作者随即插入三个重复的miR-122T,防止了体重的异常变化,维持住了小鼠较优的状态(图D):


且有效地抑制了NLS-GFP转基因的肝细胞表达,且不影响对中枢神经系统脉管系统的转导:



案例二

脂肪组织在能量和代谢稳态中起着关键作用, 但是,当前技术来调节体内脂肪功能具有挑战性。作者构建了含有巨细胞病毒启动子调控报告基因的AAV载体,使用脂联素启动子/增强子元件和肝脏特异性mir-122T靶位点,限制了报告基因对脂肪组织的表达(Scr为无义对照序列,Mir为mir-122T)。作为疗效证明,将瘦素基因掺入脂肪靶向表达载体中,包装到AAV2/8中,并静脉内给药9至10周龄的小鼠。在8周内测量表型变化。瘦素mRNA和蛋白质在脂肪中表达,瘦素蛋白分泌到血浆中。小鼠的反应是逆转体重增加,降低高胰岛素血症和改善葡萄糖耐量。


在该系统中,串联的mir-122T极大减少了病毒在肝脏的表达,且不影响瘦素对于小鼠表型的改变。


总之,AAV并不像人们想象的那么安全,尤其在高剂量使用场景下。通过优化外壳,努力提升AAV对靶细胞的噬性,降低非目的细胞的感染,从而减少剂量是临床以及动物实验努力的方向;此外,通过特异性启动子更大限定AAV在靶细胞的表达也是其优化点之一。在当前基于动物实验的AAV,若部分实验注射之后,出现小鼠死亡、体重异常变化、状态不佳等情况时,可以考虑到肝脏毒性,则可以通过上述方式,在目的基因之后插入mir-122T解除该副作用。吉凯基因长期为客户提供前沿、新颖的病毒使用策略,有兴趣的老师快来咨询吧!!!


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【参考文献】

1.Hepatotoxicity following administration of onasemnogene abeparvovec (AVXS-101) for the treatment of spinal muscular atrophy

2.Liver-specific microRNA-122 target sequences incorporated in AAV vectors efficiently inhibits transgene expression in the liver

3.A High-Efficiency AAV for Endothelial Cell Transduction Throughout the Central Nervous System

4.Targeting adipose tissue via systemic gene therapy

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