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新冠突变不断升级，试剂盒加速疫苗效价评估

作者：北京百普赛斯生物科技股份有限公司 2021-06-11T15:00 (访问量:2263)

“内防反弹，外防输入”是我国新冠疫情防控工作的重点，而近期散点疫情源头均指向境外人和物的输入。2021年5月30日，广东卫健委通报了广东新冠疫情“早茶传播链”和“境外货轮传播链”两条传播链，感染者经基因测序结果为印度变异株（B.1.617）和英国突变株（B.1.1.7）。印度变异株B.1.617的发现是继发现新冠病毒巴西突变株P.1、英国突变株B.1.1.7、南非突变株B.1.351和尼日利亚突变株B.1.525后，广东报道检测到的第五种国际主流新冠病毒突变株。

目前，越来越多的人正在接种疫苗以防护新冠疫情，据相关统计，中国已接种新冠病毒疫苗逾7.04亿剂次。而原始野生型病毒也在不断的进化，军事医学科学院微生物与流行病学研究所在《新英格兰医学杂志》上发表的文章，利用假病毒中和实验对新冠康复病人及接种灭活疫苗的血清样本进行了相关研究，报道了变异毒株可能会产生免疫逃逸。

突变毒株对体液免疫应答和抗体识别会有哪些影响？接下来有哪些思路可以防止变异毒株产生免疫逃逸？接下来介绍的文章进行了系统的研究论证。

2021年5月21日，北京大学生物医学前沿中心（BIOPIC）、北京未来基因诊断高精尖创新中心（ICG）谢晓亮课题组与合作者共同在《Cell Research》发表文章。在本研究中，谢晓亮团队利用高通量单细胞测序、冷冻电镜、病毒中和实验等多种技术手段解析了新冠病毒灭活疫苗（科兴）和RBD亚单位重组蛋白疫苗（智飞）接种者以及新冠感染康复者血浆中的中和抗体对于目前流行新冠突变株（例如南非株）的应答情况。

1. 中和抗体（NAbs）对501Y.V2突变体的中和反应研究

谢晓亮团队先通过流式细胞荧光分选技术（FACS）从科兴和智飞两款疫苗接种者以及新冠感染康复者的外周血单核细胞（PBMCs）中分离出RBD-和NTD-特异性记忆B细胞，再利用高通量单细胞测序，筛选并表达出了831个抗刺突蛋白抗体，并从中筛选出86个对新冠病毒野生型具有高中和活性的抗体。构建了携带501Y.V2（B.1.351）突变的SARS-CoV-2 VSV-假病毒，用于研究中和抗体（NAbs）对501Y.V2突变体的中和反应。

Fig.1.a. 80 种有效抗RBD NAbs对携带501Y.V2 RBD突变的假病毒的IC50变化。b. 80个抗RBD NAbs对上述突变体的IC50值的平均值。 c.抗NTD抗体对携带D614G或242-244Δ的假病毒的IC50值。

实验结果显示，在80个抗RBD NAbs中，有50个对携带K417N/E484K/N501Y突变的假病毒（RBD.V2）的中和作用降低了3倍，其中43个抗RBD NAbs的半最大抑制浓度（IC50）增加了10倍（Fig.1.a）。中和反应降低大部分是由E484K突变引起的，E484K突变可以完全抵消抗体的中和活性。N501Y和K417N突变同样会导致降低中和作用，但程度都远低于E484K突变（Fig.1.b）。抗RBD NAbs在对K417N/E484K/N501Y等RBD突变时表现出了高多样性。另一方面，由于501Y.V2携带的NTD上的242-244Δ突变会改变NTD抗原热点的蛋白构象，所以会导致抗NTD NAbs失去中和能力（Fig.1.c）。由此分析，抗NTD NAbs的多样性远少于抗RBD NAbs。

2. VH3-53/VH3-66基因型抗体对南非株中和能力研究

为了进一步证实抗RBD NAbs具有多样性，实验研究分析了18种VH3-53/VH3-66基因型抗体对南非株的中和能力。VH3-53/VH3-66型抗体是不同感染者体内共同出现的抗体，这些抗体在RBD上的表位和结构高度相同。尽管如此，VH3-53/VH3-66型抗体对突变株的反应性仍有所差异，例如：少数VH3-53/VH3-66不受突变株影响，多数VH3-53/VH3-66抗体对K417N/E484K/N501Y突变株失效。结构解析证明这部分失效的抗体主要是由于K417N突变降低了抗体互补决定区与RBD的极性相互作用引起的（Fig.2）。

Fig.2. VH3-53/VH3-66 NAbs和RBD之间相互作用的结构分析（RBD显示为表面视图，而NAbs显示为带状;红色实心矩形表示突变会导致抗体结合的显着降低。红色虚线矩形表示突变会导致抗体结合的轻微下降 )

3. 501Y.V2突变体对康复者和灭活疫苗接种者的影响

接下来，文章研究了501Y.V2突变体对康复者和灭活疫苗接种者的影响。在实验中，康复者和灭活疫苗接种者的血浆对南非突变株均表现出中和活性下降的趋势。E484K和N501Y突变导致血浆中和活性的丧失（E484K＞N501Y）；对于NTD突变，242-244Δ导致NT50滴度降低2-3倍。相比于普通流行株，新冠感染康复者和灭活疫苗接种者的血浆针对南非株的中和活性下降4倍左右。主要由E484K / N501Y和242-244Δ突变引起的，且中和作用效果减少是可叠加的（Fig.3）。

Fig.3. D614G突变体NT50变化总结（颜色渐变表示范围从 +1（白色）−6.1（蓝色）的倍数变化值。此图中的所有绘制值和水平条表示几何平均值）

4. RBD亚单位重组蛋白疫苗ZF2001相关研究
文章还对RBD亚单位重组蛋白疫苗ZF2001进行了相关研究。根据实验结果，ZF2001只受到RBD突变的影响,不受242-244Δ突变影响。研究者还在体外表达了两个ZF2001疫苗所有富集克隆的抗体序列，测试了抗D614G和RBD.V2假病毒的抗体,其诱导的抗RBD中和抗体具有丰富的多样性。

Fig.4. a. 通过假病毒中和实验，ZF2001 疫苗接种者血浆/血清 D614G到501Y.V2 的 NT50 倍数变化; b. 通过真实病毒中和实验，ZF2001 疫苗接种者血浆/血清从WT到 501Y.V2的 NT50 倍数变化

ZF2001疫苗接种者在假病毒和真实病毒检测中对501Y.V2突变的耐受性比灭活疫苗接种者和康复者高（Fig.4）。这表明RBD疫苗对501Y.V2的具有高耐受性和中和活性，可能会成为对抗携带NTD突变（例如242-244Δ）的突变体的理想选择。但RBD疫苗的疗效和突变耐受性如何随时间变化仍需进一步研究。

Fig.5. D614G突变体NT50变化总结（颜色渐变表示范围从 +1（白色）−6.1（蓝色）的倍数变化值。此图中的所有绘制值和水平条表示几何平均值）

研究还发现，与标准的RBD重组蛋白亚基疫苗三剂免疫（第0天/30天/60天）相比，第三剂和第二剂重组蛋白疫苗免疫之间的接种间隙延长（第0天/30天/140天）会产生更强中和活性的抗体（Fig.5）。这种现象可能是由于在第三剂量加强之前通过连续超突变获得了更多的成熟抗体。另外在6月4日的《新闻1+1》节目上，科兴宣布其已经完成临床二期研究，称志愿者在接种两针疫苗后3、6个月再次接种第三剂，免疫效果可增加10-20倍。而科兴将将会在接下来的时间里对保护时效进行详细的研究测试再建议接种第三剂的时间。所以，如果未来新冠突变株大流行，特别是对于携带能改变NTD抗原热点蛋白构象突变的病毒株，注射第三剂RBD重组蛋白疫苗来加强免疫或是一种优化方案。

随着世界上新冠病毒不断进行新的突变及流行，突变株对疫苗的有效性已经构成了严峻的挑战。阿斯利康和诺瓦瓦克斯南非进行的临床实验中发现，疫苗对南非突变株（B.1.351）有效性已经降低了。所以面对新冠突变株这一新的挑战，更深入地评估疫苗的有效性及安全性，并针对突变株进行疫苗新的开发，应当是接下来研究的热点方向。

为助力评估疫苗对新冠病毒变异株产生的中和保护能力，ACROBiosystems经过大量的实验摸索，在开发针对Wild type毒株中和抗体检测试剂盒（Cat. No. RAS-N022）的基础上，成功开发出针对B.1.1.7（英国突变株），B.1.351（南非突变株），P.1（巴西突变株）的中和抗体检测试剂盒。
检测原理：
试剂盒应用竞争ELISA方法。样本中的中和抗体与微孔板上固定的Human ACE2 Protein特异性竞争HRP-SARS-CoV-2 RBD/Spike。在450 nm处测定样本吸光度值（OD 450 nm），样本OD 450 nm与样本中中和抗体的含量呈负相关。
产品特点：

操作简单，方便可靠
可同时检测90+样本

应用场景：
可用于新冠疫苗的效价评估，对接种疫苗后血清样本中的中和抗体进行检测等，能够显著提高疫苗评价的效率和准确度，是对现有疫苗评价方式的重要补充。

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验证数据

经验证，使用上述ELISA试剂盒检测接种灭活疫苗的血清样本对Wild type和B.1.1.7变异株的中和能力接近，但对B.1.351和P.1毒株的中和能力明显下降（Fig.6）。

Fig.6. 新型冠状病毒中和抗体滴度检测试剂盒,包含WT-RBD（Cat. No. RAS-N022）、B.1.1.7 RBD（Cat. No. RAS-N028）、B.1.351 RBD（Cat. No. RAS-N031）、P.1 RBD（Cat. No. RAS-N034）、B.1.1.7 Spike（Cat. No. RAS-N036），B.1.351 Spike（Cat. No. RAS-N037）和P.1 Spike（Cat. No. RAS-N038），检测56份接种灭活疫苗后的血清样本中的中和抗体，以评估疫苗对SARS-CoV-2相关变异株（VOC）的疗效。

新型冠状病毒(B.1.1.7)中和抗体滴度检测试剂盒（Spike RBD)（Cat.. No. RAS-N028）用于检测中和抗体（Cat. No. S1N-M122, Cat. No. SPD-M128 和Cat. No. SPD-M180）对SARS-CoV-2 RBD/ACE2结合的抑制能力。结果表明三种抗体阻断阻断SARS-CoV-2 RBD/ACE2结合的能力强弱排序为：Cat. No. S1N-M122>Cat. No. SPD-M128>Cat. No. SPD-M180。

Fig.7. 新型冠状病毒(B.1.1.7)中和抗体滴度检测试剂盒（Spike RBD)（Cat.. No. RAS-N028）用于检测中和抗体对SARS-CoV-2 RBD/ACE2结合的抑制能力.

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新型冠状病毒（B.1.351）中和抗体滴度检测试剂盒（Spike RBD）（Cat. No. RAS-N031）用于检测中和抗体（Cat. No. S1N-M122, Cat. No. SPD-M128 和Cat. No. SPD-M180）对SARS-CoV-2 RBD/ACE2结合的抑制能力。如上图所示，Cat. No. S1N-M122阻断SARS-CoV-2RBD/ACE2结合的能力强于Cat. No. SPD-M128和Cat. No. SPD-M180。

Fig.8. 新型冠状病毒（B.1.351）中和抗体滴度检测试剂盒（Spike RBD）（Cat. No. RAS-N031）用于检测中和抗体对SARS-CoV-2 RBD/ACE2结合的抑制能力。

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