注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
生物体内巯基主要包括非蛋白质巯基和蛋白质巯基。巯基化合物在体内具有重要的解毒功
能，对生物体的自我调节具有非常重要的生理意义。
测定原理：
巯基基团与5,5’-二硫代-双-**苯甲酸（DTNB）反应，生成黄色化合物，在412nm处有最
大吸收峰。
自备实验用品：
天平、研钵、恒温水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板和甲醇。
试剂组成和配制：
提取液：液体
100 mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体
15 mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体
1 mL×1 管，4℃避光保存。
样品的制备：
1.
动物、植物组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g
组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后加入4mL甲醇，室温震荡10min，然后10000g，
4℃离心10min，取上清置冰上待测。
2.
细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞
加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）然
后10000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
3.
血清、培养液：取0.1mL，加0.4mL甲醇，室温震荡10min，然后10000g，4℃离心10min，取
上清置冰上待测。
操作步骤：
1、分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至412nm，蒸馏水调零。
2、操作表
对照管
测定管
样品（μL）
40
40
试剂一（μL）
150
150
试剂二（μL）
10
H2O（μL）
10
混匀，25℃静置，于微量石英比色皿/96孔板，测定412nm吸光值。ΔA=A测定-A对照。
计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y =1.7236 x，R2=0.9994第 2页，共 2 页
1.
组织：
非蛋白质巯基含量（μmol/g）=ΔA÷1.7236×V 反总÷ (V 样÷V 样总×W)×5
=14.5×ΔA÷W
2.
血清、培养液：
非蛋白质巯基巯基含量（μmol/mL）=ΔA÷1.7236×V 反总÷V 样×5×103=14500×ΔA
3.
细胞：
非蛋白质巯基含量（μmol/104）=ΔA÷1.7236×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)×5
=14.5×ΔA÷细胞数量
V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样：反应中样品体积，0.04mL；V 样总：加入提取液体积，
1mL；W：样品质量，g ；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；103：1mmol/L=103μmol/L
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.8618x，R2=0.9994
1.
组织：
非蛋白质巯基含量（μmol/g）=ΔA÷0.8618×V 反总÷（V 样÷V 样总×W）×5
= 29×ΔA÷W
2.
血清、培养液：
非蛋白质基含量（μmol/L）=ΔA÷0.8618×V 反总÷V 样×5×103=29000×ΔA
3.
细胞：
非蛋白质巯基含量（μmol/104）=ΔA÷0.8618×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)×5
=14.5×ΔA÷细胞数量
V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样：反应中样品体积，0.04mL；V 样总：加入提取液体积，
1mL；W：样品质量，g ；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；103：1mmol/L=103μmol/ L
注意事项
最低检出限为10μmol/L。