Topo克隆系列专题
——简单、快速、高效的克隆策略
关键词：Topo克隆 载体 连接反应 TA克隆 blunt载体 zero载体
Topo克隆技术是通过TOPO载体上偶联的异构酶(Topoisomerase)实现插入片段的快速克隆。不同于传统的TA克隆，Topo克隆技术能够在2-5min内快速完成插入片段和载体的连接反应，操作简单，连接效率极高，克隆阳性率接近100%。
背景
传统的TA克隆对于PCR产物的要求较高，而且连接反应时间很长，同时阳性率低，而且自连率很高，无形中会成倍地增加科研者宝贵的时间。翊圣生物推出Hieff CloneTM TOPO系列克隆载体，能够快速而且高效地得到目的重组载体。Hieff CloneTM Zero TOPO载体为零背景载体，载体骨架中含有**ccdB基因。此克隆方法无需蓝白斑筛选，阳性率100%。
Hieff CloneTM Zero TOPO Simple系列载体，不含多克隆酶切位点（MCS）使用者在引入后续酶切位点进行酶切操作时，不会受到载体MCS位点的影响，从而增加了克隆成功率。
TOPO克隆原理
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Topo载体两端通过磷酸键偶联Topo酶，连接反应时，受插入片段的5’端羟基的攻击，磷酸键释放能量。利用该能量，插入片段5’端羟基与载体片段3’端磷酸基团连接在一起，Topo异构酶从载体分子上脱落，完成连接反应。 |
零背景载体：Hieff CloneTM Zero Topo载体骨架中含有ccdB致死基因。当载体发生自连时，ccdB基因完整，会表达ccdB毒素蛋白，导致细菌死亡；当插入片段成功连接时，ccdB基因不完整，ccdB基因不能完整表达，细菌存活。 |
TOPO克隆与传统TA克隆方法的比较
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反应时间 |
反应温度 |
体系组成 |
克隆阳性率 |
PCR产物 |
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Zero TOPO |
2-5min |
室温 |
载体+插入片段 |
★★★★★ |
Blunt载体无需加“A” |
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传统TA克隆 |
过夜 |
16℃ |
载体+插入片段+T4连接酶 |
★★ |
需要加“A” |
产品特点
快速：仅需2-5分钟即可完成连接反应
高效：无自连现象，阳性克隆率100%
简便：只需加入目的片段即可
操作流程
产品实例
连接效率高，克隆阳性率极高
图1：Hieff CloneTM Zero TOPO-Blunt Cloning Kit可有效克隆1-5kb基因，成功率100%。A-C：TOPO克隆转化平板。D-F：插入片段PCR鉴定电泳图。
同类产品比较：
图2：相同体系下，克隆3kb目的基因，Hieff CloneTM Zero TOPO-Blunt Cloning Kit较同类产品具有高连接效率。
FAQ
Q1：从质粒上酶切的产物可直接连接Topo载体吗？为什么？
A：Topo载体进行连接反应的时候需要5`羟基端和Topo酶发生反应。PCR产物5`羟基端没有磷酸化，可以直接进行TOPO克隆。但是，酶切产物5`端为磷酸化状态，可以直接进行TA克隆的，但是不能进行Topo克隆。如果需要，可以用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）进行去磷酸化处理后连接Topo载体。
Q2：连接反应体系和反应时间以及温度对连接效率的影响大吗？
A：建议反应体系应控制在10μl内，体系太小连接会受到影响。如果目的基因浓度太低，建议浓缩之后再连接，以提高连接成功率。插入片段使用量参考说明书。一般1-2min即可完成连接反应，若想得到更多克隆，可适当延长至5min，但不能超过5min。室温反应即可。
Q3：如何选择合适的载体？
A：若PCR产物为Taq酶扩增则选择TOPO-TA克隆载体系列，若PCR产物为高保真酶扩增则选择Blunt载体系列，。Simple载体不含多克隆位点区，可根据客户需求在PCR扩增时添加自己需要的酶切位点。
Q4：若是储存了很久的PCR产物还能用来做克隆吗？
A：建议采用新鲜的PCR产物会使连接效率更高一些，若是-20℃保存的一周内还可以使用。请避免PCR产物的反复冻融和降解。
Q5：PCR扩增产物需要纯化吗？
A：先对PCR产物跑胶鉴定，若是PCR产物电泳条带单一、浓度较高且无引物二聚体可直接进行连接反应。若是有杂带或引物二聚体建议纯化之后再进行连接反应。
产品信息