应用指南 | 小鼠原代小肠类器官培养实验

1. 将小鼠安乐死。从回肠末端采集 15 厘米长的肠管。

2. 去除外膜，用冷的 PBS 冲洗。用剪刀剪开肠段，使肠腔朝上。用冰冻 PBS 轻轻清洗剪开的肠段。

3. 在 50 mL 离心管中加入 15 mL 冰冷 PBS。用剪刀将肠管剪成 1~2 mm 的小段，然后用 PBS 冲洗。重复清洗步骤，直至清澈为止。

4. 去除上清液，将组织碎片重悬于 25 mL 肠隐窝消化液（含 2-5mM EDTA）中，冰浴 20 分钟，然后在 20 rpm 旋转床上旋转 30 分钟。去除上清液。

5. 将组织碎片重悬于 10 mL 含有 10% FBS 的冷（2-8℃）PBS 缓冲溶液中。用 70 μm 过滤器过滤上清液，并将滤液装入 50 mL 的干净试管中。重复过滤 3 次，合并滤液。

6. 300×g 离心 5 分钟。弃去上清液。

7. 将沉淀重悬于 10 mL PBS 缓冲溶液中。200×g 离心 3 分钟。除去上清液。如果悬浮液中单细胞过多，请重复离心步骤。

1. 取 10 μL 细胞样本，在显微镜下计数隐窝。200×g 离心 3 分钟，取出上清液。

注：适合培养的隐窝大小不一，通常呈长方形或圆形，边缘相当光滑，看起来像上皮单层的小的折叠部分。绒毛、单细胞或碎屑浓度较高的部分不是类器官培养的理想选择。目标是最大程度地富集合适的隐窝。

2. 将隐窝重悬在肠类器官完全培养基中，每微升培养基含 8-20 个隐窝。制作完全培养基时，加入：

3. 取 150 μL 隐窝悬浮液，与等体积未稀释的 GelNest^TM 类器官专用基质胶（NEST 211272）混合，然后轻轻地用移液管上下移动十次，使其充分混合。

4. 将 50 μL 样品加入预热好的 24 孔板的每个孔的中心，形成圆顶状结构。避免形成气泡。

5. 将平板置于 37℃，静置 10 分钟，使基质凝胶凝固。小心处理平板，避免干扰凝胶。

6. 小心地向每个孔中加入 500 μL 室温（15-25℃）类器官培养基，从侧面倒入以避免扰动凝胶。

1. 监测类器官的生长。通常，在培养 3 小时左右，隐窝形成球形结构。2-4 天后，类器官开始出芽，到第5-7 天形成复杂结构。

2. 第二天完全更换培养基。小心去除孔边缘的旧培养基，加入 500 μL 新鲜的室温类器官培养基。

3. 定期在倒置显微镜下观察肠类器官并记录。

4. 选择合适的抗体对类器官进行染色，并在荧光显微镜下观察，同时包括适当的特异性对照。

5.使用NEST免费的类器官AI大模型分析软件进行识别批量、无标记分析由显微镜获取的类器官照片（不限显微镜品牌），帮助您更快、更准确的获得类器官的数量、大小（面积）、圆度、周长、灰度值（可统计荧光照片的不同类器官/细胞球的荧光强度，或明场照片的类器官亮度，从而反应类器官的死活状态）等参数，并生成统计分析结果。

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在第 2 天在 10 倍物镜下，可观察到小型空泡状结构；在第 3 天可观察到明显变大的空泡结构；在第 6 天可观察到具有多个出芽结构的小肠类器官，且培养皿里的类器官可肉眼直接观察到白色颗粒状细胞团。标尺为 200 微米。

图 2. 早期小肠类器官的细胞骨架蛋白和细胞增殖抗原的免疫染色结果。

可观察到在 GelNest^TM 基质胶中生长的早期的小肠类器官为单细胞层形成的空泡结构，并且将小肠类器官种在 100 倍稀释的 GelNest^TM 基质胶包被的平皿里，细胞仍然保持有较好的增殖能力（ki67 阳性）。

DAPI 为细胞染料核（蓝色）；alpha-Tubulin 为细胞骨架蛋白（红色）；ki67 为表达于细胞核中的细胞增殖活性的标志物。标尺为 150 微米。

可观察到在 GelNest^TM 基质胶中（3D）或者在基质胶薄层上（2D）生长的小肠类器官均能很好的保持生物功能性细胞标志物的表达。

DAPI 为细胞染料核（蓝色）；ZO-1 为细胞紧密连接蛋白标志物（绿色）；CK19 为上皮细胞特征标志物。标尺为 100微米。

可观察到在 GelNest^TM 基质胶中（3D）生长的小肠类器官能很好的保持生物功能性细胞标志物的表达。

DAPI 为细胞染料核（蓝色）；ZO-1 为细胞紧密连接蛋白标志物（绿色）；CK19 为上皮细胞特征标志物。标尺为100 微米。